Η Κατάσταση και το Μέλλον της Έρευνας της Συνείδησης

• Ερευνητική Μονάδα Γνωσιακής Νευροεπιστήμης (CNRU), CFIN, Ινστιτούτο Κλινικής Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Aarhus, Aarhus, Δανία

Καθώς οι εργασίες για τη συνείδηση ​​εισάγονται τόσο συχνά, η συνείδηση ​​μέχρι πριν από μερικές δεκαετίες θεωρούνταν μόνο ένα φιλοσοφικό πρόβλημα και το τρέχον ενδιαφέρον για την έρευνα της εμπειρικής συνείδησης ήταν απρόβλεπτο. Αυτή η εξέλιξη φυσικά επηρεάστηκε από τις τεχνολογικές εξελίξεις στη νευροεπιστήμη κατά τη διάρκεια αυτών των δεκαετιών, αλλά πιο σημαντικό και θεμελιώδες ήταν ένα νέο άνοιγμα στη διεπιστημονική ολοκλήρωση ερευνητικών ερωτημάτων, μεθόδων και επιχειρημάτων. Οι γνωστικοί επιστήμονες και οι νευροεπιστήμονες συμφώνησαν ότι τα φιλοσοφικά προβλήματα του γιατί και πώς υπάρχει συνείδηση ​​είναι επίσης προβλήματά τους. Οι φιλόσοφοι συμφώνησαν ότι τα εμπειρικά στοιχεία μπορεί να επιλύσουν ή τουλάχιστον να επηρεάσουν αυτή τη συζήτηση. Οι επιστήμονες σε όλους τους κλάδους γενικά συμφωνούν ότι η συνείδηση ​​είναι υποκειμενική, που χαρακτηρίζεται από ένα είδος προνομιακής πρόσβασης πρώτου προσώπου.

Η έρευνα συνείδησης έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας πραγματικός και λειτουργικός κλάδος ικανός να παρέχει ουσιαστικά και αναπαραγώγιμα αποτελέσματα. Παρ’ όλα αυτά, έχει ακόμη ξύσει την επιφάνεια στην προσπάθεια να λύσει κάποιες μεγαλύτερες προκλήσεις του, π.χ., τα πολλά υποκείμενα ερωτήματα της μεταφυσικής (δηλαδή, γιατί υπάρχει η συνείδηση;) και τα ζητήματα μηχανισμών (πώς υπάρχει η συνείδηση;).

Ένα σημαντικό εμπόδιο για την έρευνα της συνείδησης είναι η έλλειψη συναίνεσης σχετικά με τον τρόπο βέλτιστης μέτρησης της συνείδησης εμπειρικά. Μια άλλη σημαντική πρόκληση είναι ο τρόπος αναγνώρισης των νευρικών συσχετισμών της συνείδησης. Αυτή η πρόκληση σχετίζεται ξεκάθαρα με την πρώτη καθώς χρειάζεται να εφαρμόσει κανείς ένα μέτρο συνείδησης για να εντοπίσει τους συσχετισμούς της. Η τρέχουσα έρευνα συνείδησης είναι ήδη απασχολημένη με αυτά τα ερωτήματα που μπορεί να ειπωθεί ότι κυριαρχούν στην επιστημονική συζήτηση.

Όπως θα υποστηριχθεί παρακάτω, η έρευνα για τη συνείδηση ​​μπορεί να αντιμετωπίσει προβλήματα στο μέλλον, τα οποία επί του παρόντος συζητούνται λιγότερο, αλλά αποτελούν λογικές προεκτάσεις των παραπάνω προκλήσεων. Είναι μια φυσική φιλοδοξία όταν αναπτύσσουμε ένα μέτρο συνείδησης να μπορούμε να προσδιορίσουμε εάν τα άτομα που δεν αναφέρουν ή ακόμα και οι μηχανές έχουν συνείδηση ​​και τι. Και είναι μια φυσική φιλοδοξία όταν βρίσκουμε νευρικούς συσχετισμούς της συνείδησης να κατανοήσουμε πώς αυτές οι συσχετίσεις σχετίζονται με μια βαθύτερη μεταφυσική κατανόηση της σχέσης μεταξύ της υποκειμενικής εμπειρίας και του φυσικού υποστρώματος του εγκεφάλου.

Πώς μετράμε τη συνείδηση;

Ιστορικά, η προσπάθεια «μέτρησης» της συνείδησης έχει εκτυλιχθεί ως μια συζήτηση μεταξύ άμεσων και έμμεσων προσεγγίσεων. Οι άμεσες προσεγγίσεις, τουλάχιστον διαισθητικά, είναι οι πιο ενημερωτικές καθώς τα συμμετέχοντα πειραματικά υποκείμενα εδώ απλώς αναφέρουν τις δικές τους εμπειρίες. Καθώς ωστόσο οι υποκειμενικές αναφορές έχουν αποδεδειγμένα όρια (π.χ. έλλειψη γνώσης για την προσωπική προκατάληψη, προβλήματα μνήμης κ.λπ.), πολλοί επιστήμονες απέφυγαν από τη χρήση τους και επέμειναν στη χρήση μόνο αντικειμενικών μέτρων (π.χ. Nisbett and Wilson, 1977; Johansson et. al., 2006).

Πειράματα επί της συνείδησης που βασίζονται σε αντικειμενικά μέτρα – η «έμμεση» προσέγγιση – συνήθως περιλαμβάνουν ζητώντας από τα υποκείμενα να επιλέξουν μεταξύ εναλλακτικών λύσεων, π.χ. σε εργασίες αναγκαστικής επιλογής. Παρόλο που τέτοιες μέθοδοι μπορεί να μένουν μακριά από τους κλασικούς περιορισμούς των υποκειμενικών μεθόδων, αντιμετωπίζουν άλλα προβλήματα, τα οποία, σύμφωνα με ορισμένους επιστήμονες, είναι μεγαλύτερα. Πρώτον, τα αντικειμενικά μέτρα πρέπει να υποθέσουν ότι το «κατώφλι» για να δοθεί μια σωστή απάντηση είναι το ίδιο με το «κατώφλι» της ύπαρξης μιας υποκειμενικής εμπειρίας του ίδιου περιεχομένου (Fu et al., 2008; Timmermans and Cleeremans, 2015). Επιπλέον, για να καταλήξει κανείς σε μια συγκεκριμένη αντικειμενική μέθοδο, πρέπει να την έχει «βαθμονομήσει» σε κάτι άλλο για να γνωρίζει ότι αυτή η συγκεκριμένη συμπεριφορά μπορεί να θεωρηθεί μέτρο συνείδησης – και όχι κάτι άλλο.

Οι υποστηρικτές της «άμεσης» προσέγγισης προσπάθησαν να αναπτύξουν ακριβείς και ευαίσθητες κλίμακες για να καταγράψουν μικρές παραλλαγές στην υποκειμενική εμπειρία, π.χ. την κλίμακα αντιληπτικής επίγνωσης και βαθμιαίες αξιολογήσεις εμπιστοσύνης (Ramsøy και Overgaard, 2004· Sandberg και Overgaard, 2015). Αν και διαφορετικές προσεγγίσεις αυτής της ιδέας διαφωνούν σχετικά με το τι συνιστά το βέλτιστο μέτρο (Dienes and Seth, 2010; Timmermans et al., 2010; Szczepanowski et al., 2013), συμμερίζονται την άποψη ότι μια λεπτομερής υποκειμενική αναφορά μπορεί να είναι ανακριβής αλλά καλύτερη από ένα έμμεσο μέτρο.

Τα τελευταία χρόνια, το οπλοστάσιο των έμμεσων μέτρων έχει εφοδιαστεί με αυτό που ονομάζεται «παράδειγμα χωρίς αναφορά». Ουσιαστικά, όλα τα παραδείγματα που χρησιμοποιούν μόνο αντικειμενικά μέτρα είναι χωρίς αναφορά, επομένως, υπό μια ορισμένη έννοια, τα παραδείγματα που ονομάζονται «παράδειγμα χωρίς αναφορά» δεν έχουν εισαγάγει τίποτα νέο. Ωστόσο, πειράματα αυτού του είδους επιχειρούν πρώτα να συσχετίσουν ένα συγκεκριμένο αντικειμενικό μέτρο (π.χ. μια συμπεριφορά ή μια ενεργοποίηση του εγκεφάλου) με τη συνειδητή εμπειρία και στη συνέχεια να εφαρμόσουν αυτό το μέτρο ως μέτρο συνείδησης, ώστε να μην χρειάζεται άμεση αναφορά (π.χ. Frässle et al., 2014· Pitts et al., 2014). Τέτοιες μέθοδοι φαίνεται διαισθητικά να παρακάμπτουν ορισμένες από τις επικρίσεις που αναφέρθηκαν παραπάνω. Ωστόσο, και όπως προαναφέρθηκε,

Έχει προταθεί ότι ο καλύτερος και πιο πρακτικός τρόπος είναι να συνδυάσουμε μεθόδους και να μάθουμε τι μπορούμε από τα αποτελέσματα που παίρνουμε (Tsuchiya et al., 2016). Ενώ αυτό είναι πιθανότατα απαραίτητο, είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι διαφορετικές μέθοδοι φαίνεται να παράγουν διαφορετικά αποτελέσματα, έτσι ώστε ορισμένες μέθοδοι συνδέονται με τη διαπίστωση ότι οι νευρικοί συσχετισμοί της οπτικής συνείδησης περιλαμβάνουν προμετωπιαία δραστηριότητα, ενώ άλλες μέθοδοι σχετίζονται με διαπιστώνοντας ότι η οπτική συνείδηση ​​περιλαμβάνει κυρίως ινιακή/βρεγματική δραστηριότητα αλλά όχι προμετωπιαία.

Νευρωνικοί συσχετισμοί της συνείδησης

Οι περισσότερες νευροεπιστημονικές έρευνες για τη συνείδηση ​​είχαν ρητό στόχο να εντοπίσουν τους νευρικούς συσχετισμούς της συνείδησης. Αν και σπάνια συζητείται τι εννοούμε με έναν «νευρικό συσχετισμό της συνείδησης», τα περισσότερα πειράματα στοχεύουν στον εντοπισμό των ελάχιστων νευρικών ενεργοποιήσεων που επαρκούν για ένα συγκεκριμένο περιεχόμενο της συνείδησης (Chalmers, 2000). Σε αντίθεση με αυτό, άλλοι επιστήμονες ασχολούνται με την εύρεση νευρικών συσχετισμών της συνείδησης «καθαυτού»—δηλαδή, νευρικών συσχετισμών που σηματοδοτούν τη διαφορά μεταξύ του να είσαι νεκρός, κοιμισμένος, ξύπνιος κ.λπ., και οι οποίοι δεν είναι συγκεκριμένοι περιεχομένου με την παραπάνω έννοια.

Όσον αφορά την προσπάθεια απομόνωσης νευρικών συσχετισμών συνειδητού περιεχομένου, μια κεντρική συζήτηση τα τελευταία χρόνια ήταν εάν οι νευρικές συσχετίσεις της συνείδησης πρέπει να συνδέονται κυρίως με τον προμετωπιαίο φλοιό («όψιμες» ενεργοποιήσεις) ή εάν η (οπτική) συνείδηση ​​πρέπει να συσχετίζεται με τον ινιακό /βρεγματικές ενεργοποιήσεις («πρώιμες» ενεργοποιήσεις). Σύμφωνα με τις πιο πρόσφατες ανασκοπήσεις και άρθρα, τα στοιχεία υποστηρίζουν την τελευταία άποψη (Andersen et al., 2016; Koch et al., 2016; Hurme et al., 2017). Σύμφωνα με αυτή την άποψη, οι «όψιμες» ενεργοποιήσεις δεν είναι πραγματικοί συσχετισμοί της συνείδησης, αλλά είναι συγχύσεις που σχετίζονται με τη μεταγνώση και την αναφορά (π.χ., Aru et al., 2012). Παρ ‘όλα αυτά,

Σύμφωνα με άλλες απόψεις, αυτή η συζήτηση είναι εν μέρει παρεξηγημένη. Ο Block (2005) υποστηρίζει ότι μπορεί να υπάρχουν δύο νευρωνικοί συσχετισμοί της συνείδησης: ένας που σχετίζεται με τη φαινομενική συνείδηση ​​(οι «πρώιμες» ενεργοποιήσεις) και ένας που σχετίζεται με τη συνείδηση ​​πρόσβασης (οι «όψιμες» ενεργοποιήσεις). Άλλοι προτείνουν ότι υπάρχει μια ταυτότητα μεταξύ της υποκειμενικής εμπειρίας και ορισμένων αιτιακών ιδιοτήτων των φυσικών συστημάτων παρά μια ταυτότητα μεταξύ της εμπειρίας και συγκεκριμένων τμημάτων του εγκεφάλου (Tononi et al., 2016). Σύμφωνα με το μοντέλο συνείδησης REF-CON, η υποκειμενική εμπειρία σχετίζεται εγγενώς με ένα συγκεκριμένο είδος «στρατηγικής» που κάνει τις πληροφορίες διαθέσιμες για δράση (Overgaard και Mogensen, 2014· Mogensen και Overgaard, 2017). Από αυτή την άποψη, δεν χρειάζεται να υπάρχει κανένας «καθολικός» συσχετισμός της συνείδησης.

Υπήρξε σχετικά περισσότερη έρευνα για τους νευρικούς συσχετισμούς του περιεχομένου της συνείδησης παρά για τη «συνείδηση ​​καθαυτή». Η έρευνα που επιχειρεί να εντοπίσει συγκεκριμένα «επίπεδα» συνείδησης προφανώς αντιμετωπίζει επίσης πολλές μεθοδολογικές προκλήσεις, ιδίως σε σχέση με την αντιθετική ανάλυση. Ορισμένες μελέτες έχουν προσπαθήσει να αντιπαραβάλουν υγιή άτομα με ασθενείς σε βλαστική κατάσταση ή σε κατάσταση ελάχιστης συνείδησης (Boly et al., 2013), αν και υπάρχουν ορισμένα προβλήματα: Ορισμένα πειράματα δείχνουν ότι δεν είναι όλοι αυτοί οι ασθενείς αναίσθητοι (Owen et al., 2006), και —ταυτόχρονα— οι περισσότεροι ασθενείς με εγκεφαλική βλάβη έχουν πολλές διαφορετικές βλάβες και, κατά συνέπεια, μαζική αναδιοργάνωση, γεγονός που καθιστά τις συγκρίσεις πολύ δύσκολες.

Οι Μελλοντικές Προκλήσεις

Η «έξαρση» του ενδιαφέροντος για μια επιστήμη της συνείδησης δεν ξεκίνησε, αλλά σίγουρα απογειώθηκε με τις δημοσιεύσεις του Chalmers (1995, 1996) και της σειράς συνεδρίων με βάση το Tucson «Toward a Science of Consciousness»—που σύντομα θα ενισχυθεί περαιτέρω από το ετήσια συνέδρια που διοργανώνει η ASSC (Association for the Scientific Study of Consciousness). Από τότε, πολλά έχουν συμβεί στην προσπάθεια να ανακαλυφθούν νευρικοί και γνωστικοί συσχετισμοί της συνείδησης. Ωστόσο, είναι τόσο αβέβαιο σήμερα όσο και τότε πώς ακριβώς θα εφαρμοστούν αυτά τα ευρήματα. Κατ’ αρχήν, υπάρχουν πολλές πιθανές εφαρμογές της έρευνας της συνείδησης, αλλά ενώ ορισμένες είναι προεκτάσεις των πιο θεμελιωδών ερωτημάτων (π.χ. ηθική και νόμος), άλλες είναι κοντά στην καρδιά του τι είναι η έρευνα συνείδησης (αναμφισβήτητα), π.χ. -πρόβλημα εγκεφάλου ή μυαλού-σώματος.

Ένα τέτοιο θεμελιώδες πρόβλημα σχετίζεται με το γεγονός ότι η συνείδηση ​​είναι υποκειμενική και με αυτόν τον τρόπο προσιτή μόνο από το πρώτο πρόσωπο. Ενώ εξακολουθούμε να μην έχουμε καθολικά αποδεκτά μέτρα συνείδησης, έχει σημειωθεί μεγάλη πρόοδος όσον αφορά το πώς μπορεί κανείς να κατανοήσει το περιεχόμενο μιας εμπειρίας στο πλαίσιο ενός πειράματος. Μια σημαντική μελλοντική πρόκληση θα είναι ο τρόπος μέτρησης της συνείδησης «από έξω». Αυτό το πρόβλημα αντιμετωπίζεται επί του παρόντος σε ασθενείς με κώμα και βλαστική κατάσταση που είτε δεν ανταποκρίνονται είτε ανταποκρίνονται με ελάχιστο ή περίεργο τρόπο. Είναι πολύ πιθανό να είναι ακόμη μεγαλύτερη πρόκληση για μια μελλοντική επιστήμη της συνείδησης να εξετάσει πώς να αξιολογήσει εάν τα τεχνητά συστήματα (π.χ. υπολογιστές ή ρομπότ) μπορούν να είναι συνειδητά ή εάν η εμπειρία είναι προνόμιο για τα βιολογικά πλάσματα. Ουσιαστικά, Αυτά τα ερωτήματα μας αναγκάζουν να προσπαθήσουμε να λάβουμε επιστημονικά τεκμηριωμένες αποφάσεις σχετικά με τον τρόπο μέτρησης της συνειδητής εμπειρίας σε πολύ διαφορετικές καταστάσεις: Σε ασθενείς με κώμα/φυτική κατάσταση, υπάρχουν ελάχιστες ή καθόλου απαντήσεις, αλλά ένα νευρικό (όσο αλλοιωμένο) σύστημα. Σε τεχνητά συστήματα, μπορεί να υπάρχει υψηλή ανταπόκριση (ακόμα και, κατ’ αρχήν, ρητές εκφράσεις της συνειδητότητας) αλλά όχι νευρικό (βιολογικό) σύστημα.

Μια πιθανώς ακόμη μεγαλύτερη πρόκληση θα είναι η επανένταξη της φιλοσοφικής μεταφυσικής συζήτησης στο επιστημονικό έργο. Θα είναι μια πρόκληση για τη μελλοντική επιστήμη της συνείδησης να αποδείξει ότι η εμπειρική εργασία στη συνείδηση ​​βοηθά άμεσα στην κατανόηση των θεμελιωδών ερωτημάτων σχετικά με τη συνείδηση. Αυτή η πρόκληση μπορεί να φαίνεται αναπόφευκτη καθώς η τρέχουσα ενασχόληση με τις γνωστικές λειτουργίες και τις νευρικές ενεργοποιήσεις που σχετίζονται με την υποκειμενική εμπειρία στις περισσότερες περιπτώσεις φαίνεται τόσο άμεσα συνδεδεμένη και υποκινούμενη από το πρόβλημα νου-εγκεφάλου. Τα υπάρχοντα δεδομένα, ωστόσο, φαίνεται να ταιριάζουν εύκολα σε κάθε θεωρητική κατανόηση αυτού του προβλήματος. Από μόνη της, Δεν φαίνεται να ισχύει ότι η απόδειξη ότι η αντιληπτική εμπειρία σχετίζεται με —ας πούμε— δραστηριότητα στον πρωτογενή οπτικό φλοιό παρέχει επίσης στοιχεία για να καθοριστεί εάν η συνείδηση ​​πρέπει να θεωρείται —ας πούμε— ταυτόσημη ή μεταφυσικά διαφορετική από την εγκεφαλική δραστηριότητα. Κατά συνέπεια, θα απαιτηθεί κάτι «έξτρα» για να απαντηθεί αυτή η πρόκληση. Είτε, εάν είναι δυνατόν, πρέπει να σχεδιαστούν πειραματικές έρευνες προκειμένου να «δοκιμαστούν» θεωρητικές θέσεις που διατυπώνονται επί του παρόντος στο πλαίσιο της φιλοσοφίας του νου. Εναλλακτικά, η πειραματική έρευνα συνείδησης πρέπει να συνεργάζεται ακόμη πιο κοντά με τη θεωρητική έρευνα συνείδησης προκειμένου να διατίθενται εμπειρικά δεδομένα ως επιχειρήματα. Οι πειραματικές έρευνες πρέπει να σχεδιάζονται για να «δοκιμάζουν» θεωρητικές θέσεις που διατυπώνονται επί του παρόντος στο πλαίσιο της φιλοσοφίας του νου. Εναλλακτικά, η πειραματική έρευνα συνείδησης πρέπει να συνεργάζεται ακόμη πιο κοντά με τη θεωρητική έρευνα συνείδησης προκειμένου να διατίθενται εμπειρικά δεδομένα ως επιχειρήματα. Οι πειραματικές έρευνες πρέπει να σχεδιάζονται για να «δοκιμάζουν» θεωρητικές θέσεις που διατυπώνονται επί του παρόντος στο πλαίσιο της φιλοσοφίας του νου. Εναλλακτικά, η πειραματική έρευνα συνείδησης πρέπει να συνεργάζεται ακόμη πιο κοντά με τη θεωρητική έρευνα συνείδησης προκειμένου να διατίθενται εμπειρικά δεδομένα ως επιχειρήματα.

Μελλοντικές κατευθύνσεις

Οι προκλήσεις που επισημάνθηκαν παραπάνω αντιπροσωπεύουν προφανώς μόνο μερικά από τα πολλά επιστημονικά και θεωρητικά ζητήματα που αντιμετωπίζουν οι επιστήμονες σε αυτόν τον τομέα. Η συνείδηση ​​παραμένει μια από τις μεγαλύτερες επιστημονικές προκλήσεις μεταξύ όλων των επιστημών, καθώς τα πιο θεμελιώδη ερωτήματα δεν είναι απλά αναπάντητα – είναι ακόμα πολύ ασαφές πώς θα πρέπει να αρχίσει κανείς να τις απαντά.

Επί του παρόντος, η έρευνα για τη συνείδηση ​​συχνά θεωρείται «θέμα» -ή ακόμα και «θέση» – κάτω από την ομπρέλα της γνωστικής νευροεπιστήμης. Ωστόσο, οι ερευνητές της συνείδησης συχνά επισημαίνουν ότι η υποκειμενική εμπειρία είναι ο υποκείμενος και θεμελιώδης λόγος για πολλά ερωτήματα στη νευροεπιστήμη. Οι επιστήμονες που ενδιαφέρονται για τον εγκέφαλο συχνά αναζητούν απαντήσεις σε ερωτήματα όπως γιατί εθιζόμαστε, πώς θυμόμαστε, αντιλαμβανόμαστε ή λύνουμε προβλήματα. Τέτοιες ερωτήσεις αναμφισβήτητα προϋποθέτουν συνειδητή εμπειρία και δεν έχουν νόημα χωρίς αυτό. Όροι όπως «μνήμη» ή «αντίληψη» δεν αναφέρονται μόνο στη συμπεριφορά, αλλά και σε συγκεκριμένα είδη συνειδητού περιεχομένου για τα οποία γνωρίζουμε από την ενδοσκόπηση. Για αυτόν τον λόγο, μια μελλοντική φιλοδοξία για την έρευνα της συνείδησης θα μπορούσε να είναι να γίνει πιο αναπόσπαστο μέρος της συνολικής φιλοδοξίας για την κατανόηση του εγκεφάλου,

Συνεισφορές Συγγραφέων

Ο συγγραφέας επιβεβαιώνει ότι είναι ο μοναδικός συνεργάτης αυτού του έργου και το ενέκρινε για δημοσίευση.

Δήλωση Σύγκρουσης Συμφερόντων

Ο συγγραφέας δηλώνει ότι η έρευνα διεξήχθη ελλείψει εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

NKX2-8/PTHrP Οστεοκλαστογένεση και οστική μετάσταση στον καρκίνο του μαστού με τη μεσολάβηση του άξονα

• ¹ Key Laboratory of Liver Disease of Liver Disease of Guangdong Province, The Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China
• ² Τμήμα Βιοχημείας, Ιατρική Σχολή Zhongshan, Πανεπιστήμιο Sun Yat-sen, Guangzhou, Κίνα
• ³ Κρατικό Εργαστήριο Ογκολογίας στη Νότια Κίνα, Κέντρο Καρκίνου, Συνεργατικό Κέντρο Καινοτομίας για την Ιατρική του Καρκίνου, Πανεπιστήμιο Sun Yat-sen, Guangzhou, Κίνα
• ⁴ Τμήμα Ογκολογίας, The First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Κίνα

Η οστική μετάσταση είναι μια από τις πιο κοινές απομακρυσμένες μεταστάσεις του καρκίνου του μαστού, που θα μπορούσε να προκαλέσει σοβαρή σκελετική νόσο και αυξημένο θάνατο που σχετίζεται με τον καρκίνο. Ως εκ τούτου, η αναγνώριση νέων στόχων για την ανάπτυξη θεραπευτικών μεθόδων θα βελτίωνε τα αποτελέσματα των ασθενών. Ο ρόλος του NKX2-8 στη ρύθμιση της αναδιαμόρφωσης των οστών προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασίες οστεοκλαστογένεσης και μικρο-CT. Η έκφραση του NKX2-8 εξετάστηκε μέσω ανοσοϊστοχημείας σε 344 ιστούς καρκίνου του μαστού. Ο μηχανισμός που διέπει την υπορρύθμιση της PTHrP με τη μεσολάβηση NKX2-8 διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση δέσμευσης βιοτινυλιωμένης απενεργοποιημένης Cas9, ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης, προσδιορισμούς συν-ανοσοκαθίζησης. Ένα μοντέλο ποντικού με μεταστατικό οστό χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί η επίδραση της απορρύθμισης NKX2-8 στη μετάσταση στα οστά του καρκίνου του μαστού και η επίδραση τριών αναστολέων PTHrP στην πρόληψη της οστικής μετάστασης του καρκίνου του μαστού. Η μειωμένη έκφραση του NKX2-8 συσχετίστηκε σημαντικά με τη μετάσταση στα οστά του καρκίνου του μαστού. In vivo μοντέλο ποντικού με μεταστατικό οστό έδειξε ότι η σίγαση του NKX2-8 προήγαγε, αλλά η υπερέκφραση του NKX2-8 ανέστειλε την οστεολυτική οστική μετάσταση και την οστεοκλαστογένεση του καρκίνου του μαστού. Μηχανιστικά, το NKX2-8 αλληλεπιδρά άμεσα με το HDAC1 στον προαγωγέα PTHrP, το οποίο οδήγησε σε μείωση της ακετυλίωσης της ιστόνης H3K27, κατά συνέπεια μεταγραφικά μείωσε την έκφραση της PTHrP στα καρκινικά κύτταρα του μαστού. Επιπλέον, η στόχευση της PTHrP ανέστειλε αποτελεσματικά τη μετάσταση των οστών του καρκίνου του μαστού που προκαλείται από τη μείωση της ρύθμισης του NKX2-8. Λαμβάνονται μαζί,

Εισαγωγή

Πρόσφατα, αναφέρθηκε πρόσφατα ότι η συχνότητα του καρκίνου του μαστού έχει γίνει η υψηλότερη και μία από τις κορυφαίες αιτίες θανάτου από καρκίνο στον κόσμο (1), που προκαλείται γενικά από την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων σε απομακρυσμένα όργανα, όπως τα οστά, τον εγκέφαλο. , συκώτι και πνεύμονες (2). Πάνω από το 70% του προχωρημένου καρκίνου του μαστού αναπτύσσει οστική μετάσταση που μείωσε σημαντικά την ποιότητα ζωής και την επιβίωση των ασθενών (3, 4). Ωστόσο, οι τρέχουσες θεραπείες για οστικές μεταστάσεις έχουν περιορισμένη αποτελεσματικότητα. Παρά την προσωρινή επίδραση των διφωσφονικών και της δενοσουμάμπης (ένας ενεργοποιητής αντι-υποδοχέα του μονοκλωνικού αντισώματος του συνδέτη NF-κB (RANKL)) στη μείωση του κινδύνου σχετιζόμενων με το σκελετό συμβάντων (SREs), δεν έχει παρατηρηθεί σημαντική επίδραση όσον αφορά τη συνολική επιβίωση. Ετσι,

Οι μεταστάσεις στα οστά από καρκίνο του μαστού είναι ως επί το πλείστον οστεολυτικές μεταστάσεις, που προκαλούνται από τη στρατολόγηση και την ενεργοποίηση οστεοκλαστών στη διεπιφάνεια όγκου-οστού για να σχηματιστεί ανώμαλη οστική απορρόφηση (5). Τα στοιχεία αποδεικνύουν ότι οι παράγοντες που εκκρίνονται από τον καρκίνο ενεργοποίησαν άμεσα ή έμμεσα τους οστεοκλάστες για να απορροφήσουν τη μήτρα των οστών, οδηγώντας στο σχηματισμό μιας «προμεταστατικής θέσης των οστών» για την υποστήριξη της μετάστασης στα οστά, δημιουργώντας έτσι έναν «φαύλο κύκλο» μεταξύ των μεταστατικών κυττάρων όγκου και η οστική προμεταστατική κόγχη (4, 5). Το πεπτίδιο που σχετίζεται με την παραθυρεοειδική ορμόνη (PTHrP) είναι οι πιο σημαντικοί παράγοντες ενεργοποίησης των οστεοκλαστών που απελευθερώνονται από τα καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των καρκινικών κυττάρων του μαστού (3). Έχει αποδειχθεί ότι τα καρκινικά κύτταρα του μαστού δεν εκφράζουν RANKL, αλλά παράγουν PTHrP για να αυξήσουν την έκκριση RANKL από τους οστεοβλάστες για να ενεργοποιήσουν τους οστεοκλάστες (6).

Το ανθρώπινο Nk2 homeobox 8 (NKX2-8), ένας μεταγραφικός παράγοντας που σχετίζεται με το NK2, αναφέρθηκε ότι ρυθμίζεται προς τα κάτω σε πολλαπλούς όγκους, γεγονός που συνέβαλε στην έναρξη, την εξέλιξη και την ανάπτυξη του καρκίνου (7–13). Οι προηγούμενες μελέτες μας έδειξαν ότι η προς τα κάτω ρύθμιση του NKX2-8 συνέβαλε σημαντικά στην κακοήθη εξέλιξη και ανάπτυξη καρκίνου της ουροδόχου κύστης (10) και πλακώδους καρκινώματος οισοφάγου (11), και η διαγραφή του NKX2-8 προσέδιδε χημειοανθεκτικότητα στον επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (13). Εδώ, δείξαμε ότι το NKX2-8 μείωσε μεταγραφικά την έκφραση της PTHrP μέσω άμεσης αλληλεπίδρασης με την αποακετυλάση ιστόνης 1 (HDAC1) στον προαγωγέα PTHrP, με αποτέλεσμα τη μείωση της ακετυλίωσης της ιστόνης H3K27, η οποία μείωσε μεταγραφικά το επίπεδο PTHrP στον καρκίνο του μαστού. Η αποσιώπηση της έκφρασης της PTHrP που επάγεται από το NKX2-8 για την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών, η οποία δημιούργησε μια υποστηριζόμενη από μετάσταση οστού «προμεταστατική θέση των οστών». Αυτά τα αποτελέσματα όχι μόνο κατέδειξαν τον κρίσιμο ρόλο της μείωσης του NKX2-8 στην προκαλούμενη από οστεοκλαστογένεση οστική μετάσταση καρκίνου του μαστού, αλλά αντιπροσωπεύουν επίσης μια πιθανή θεραπευτική στρατηγική για τη θεραπεία της οστικής μετάστασης του καρκίνου του μαστού με NKX2-8.

Υλικά και μέθοδοι

Κυτταρικές γραμμές και κυτταρική καλλιέργεια

Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, συμπεριλαμβανομένων των MDA-MB-231 και SCP2, πρόδρομων οστεοκλαστών Raw 264.7 κύτταρα και πρόδρομων οστεοβλαστών κύτταρα MC3T3-E1 καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle’s Dulbecco (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, USA) συν με 10 % εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS, Gibco). Η κυτταρική σειρά SCP2 παρασχέθηκε ευγενικά από τον καθηγητή Guohong Hu στη Σχολή Ιατρικής, την Κινεζική Ακαδημία Επιστημών και το Πανεπιστήμιο Jiao Tong της Σαγκάης. Οι προαναφερθείσες κυτταρικές σειρές έχουν εξεταστεί ως προς τη μόλυνση του μυκοπλάσματος και έχουν επιβεβαιωθεί με δακτυλικά αποτυπώματα σύντομης διαδοχικής επανάληψης (STR) στο τμήμα Ιατροδικαστικής του Πανεπιστημίου Sun Yat-Sen (Κίνα).

Πλασμίδια, Ρετροϊική Λοίμωξη και Μεταμόλυνση

Ο ρετροϊικός φορέας pMSCV-neo χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή του πλασμιδίου pMSCV-neo/NKX2-8. Κοντά RNA φουρκέτας (shRNAs) που στοχεύουν NKX2-8, PTHrP και HDAC1 κλωνοποιήθηκαν στον ιικό φορέα pSuper Retro. Οι λεπτομερείς πληροφορίες των ολιγονουκλεοτιδίων shRNA παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1. Η περιοχή του ανθρώπινου προαγωγέα PTHrP, η οποία περιελάμβανε νουκλεοτίδια από -2000 έως 500 γύρω από τη θέση έναρξης της μεταγραφής, υποκλωνοποιήθηκε σε φορέα αναφοράς λουσιφεράσης pGL3-Control (Promega, Madison, WI, ΗΠΑ). Σταθερές κυτταρικές σειρές που εκφράζουν NKX2-8, ή NKX2-8 shRNA(s), PTHrP shRNA(s) και HDAC1 shRNA(α) καθιερώθηκαν με ρετροϊική μόλυνση και επιλογή 10 ημερών με πουρομυκίνη (0,5 μg/mL).

Εξαγωγή RNA, Αντίστροφη Μεταγραφή και PCR σε πραγματικό χρόνο

Το αντιδραστήριο Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την εξαγωγή ολικού RNA από τα υποδεικνυόμενα κύτταρα που εκτελέστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το εκχυλισμένο RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA, το οποίο χρησιμοποιήθηκε στο στάδιο ποσοτικής PCR πραγματικού χρόνου του πρωτοκόλλου ποσοτικής αντίστροφης μεταγραφής PCR σε πραγματικό χρόνο (qRT-PCR). Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν για qRT PCR σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Primer Express v 2.0 (Applied BioSystems, Foster City, CA, USA). Το επίπεδο έκφρασης των υποδεικνυόμενων γονιδίων κανονικοποιήθηκε στην έκφραση του γονιδίου housekeeping GAPDH (που κωδικοποιεί γλυκεραλδεΰδη-3-φωσφορική αφυδρογονάση) και υπολογίστηκε ως 2 – [(Ct ^{του γονιδίου) – (Ct του GAPDH)]} , το οποίο Ct έδειξε το κατώφλι του κύκλου για κάθε γονίδιο. Όλοι οι εκκινητές παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1.

Δοκιμασία Λουσιφεράσης

Συνολικά 1 × 10 ³ υποδεικνυόμενα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 48 φρεάτια για 24 ώρες και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με πλασμίδια αναφοράς λουσιφεράσης ελέγχου ή αντίστοιχα πλασμίδια αναφοράς λουσιφεράσης (100 ng) και πλασμίδιο ρενίλας pRL-TK (5 ng) (Promega, Madison, WI) χρησιμοποιώντας το Lipofectamine 3000 αντιδραστήριο (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Το Dual Luciferase Reporter Assay Kit (Promega, Madison, WI) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των σημάτων λουσιφεράσης και ρενίλας μετά τη διαμόλυνση στις 48 ώρες χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή.

Δοκιμασία ανοσοκαθίζησης χρωματίνης (ChIP).

Το κιτ δοκιμασίας ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης (ChIPs) (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ, ΗΠΑ) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό ChIP σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα υποδεικνυόμενα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε δίσκο καλλιέργειας 100 mm γύρω από συρροή 70%~80% και στερεώθηκαν σε πρωτεΐνες διασταυρούμενης σύνδεσης με DNA χρησιμοποιώντας φορμαλδεΰδη 1%. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε υπερήχους για διάτμηση του DNA σε μικρά ομοιόμορφα θραύσματα. Ίσες ποσότητες υπερκειμένων με χρήση αντι-NKX2-8 (Abcam), ή αντι-HDAC1 (Abcam) ή αντι-H3K27ac (Abcam) και αντι-IgG αντισωμάτων (Milipore, Billerica, MA) με μαγνητικά σφαιρίδια πρωτεΐνης G ανοσοκατακρημνίστηκαν κατά τη διάρκεια της νύχτας σε 4°C. Τα διασυνδεδεμένα σύμπλοκα πρωτεΐνης/DNA συλλέχθηκαν με μαγνητική έλξη προς τα κάτω και στη συνέχεια εκλούστηκαν από τα σφαιρίδια με ρυθμιστικό έκλουσης. Η ανάλυση PCR με τους υποδεικνυόμενους εκκινητές διεξήχθη χρησιμοποιώντας το ελεύθερο DNA που αντιστράφηκε από σύμπλοκα διασυνδεδεμένης πρωτεΐνης/DNA. Οι ενδεικνυόμενοι εκκινητές ChIP φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1.

Χημικά Αντιδραστήρια

3 τύποι αναστολέων PTHrP, το εξουδετερωτικό αντίσωμα PTHrP (Τ-4512) αγοράστηκαν από την Bachem (Torrance, CA, USA). Η 6-θειογουανίνη (6-TG) αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ) και η PTHrP7-34 από την GL Biochem (Σαγκάη, Κίνα).

Ενζυμική Ανοσοροφητική Δοκιμασία (ELISA)

Το επίπεδο PTHrP στο μέσο καλλιέργειας από καρκινικά κύτταρα μαστού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ELISA ανθρώπινης PTHrP (πρωτεΐνη που σχετίζεται με την παραθυρεοειδική ορμόνη) (EH1058, FineTest, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd., Wuhan, Κίνα) και αναλύθηκε σύμφωνα με οδηγίες του κατασκευαστή. Τα επίπεδα μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα βήτα (TGF-β), RANKL και οστεοπρωτεγερίνης (OPG) στο μέσο καλλιέργειας μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ELISA TGF-β ποντικού (ab119557), κιτ ELISA RANKL ανθρώπου (ab213841), κιτ ELISA RANKL ποντικού (ab10 ), κιτ ανθρώπινου OPG ELISA (ab100617) και κιτ OPG ELISA ποντικού (ab203365), αντίστοιχα. Ο SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάγνωση δεδομένων στα 450 nm.

Πληροφορίες Ασθενούς

Σε αυτή τη μελέτη διεξήχθησαν συνολικά 20 φυσιολογικοί ιστοί μαστού γειτονικοί με όγκο και 344 δείγματα καρκίνου του μαστού ενσωματωμένα σε παραφίνη. Όλα τα δείγματα που διαγνώστηκαν ιστοπαθολογικά και κλινικά στο τρίτο Συνεργαζόμενο Νοσοκομείο, το Πανεπιστημιακό Κέντρο Καρκίνου Sun Yat-sen και το Πρώτο Συνεργαζόμενο Νοσοκομείο από το 2005 έως το 2019. Τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας Θεσμικής Έρευνας της Sun Yat- sen University για τη χρήση αυτών των κλινικών υλικών για ερευνητικούς σκοπούς. Όλα τα δείγματα των ασθενών ελήφθησαν σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και κάθε ασθενής υπέγραψε γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση για όλες τις διαδικασίες.

Ανοσοϊστοχημεία (IHC).

Η δοκιμασία IHC χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση του επιπέδου πρωτεΐνης NKX2-8 μέσω αντισώματος αντι-NKX2-8 (1:100, Sigma-Aldrich Cat# AV31856) και του επιπέδου πρωτεΐνης PTHrP μέσω αντισώματος αντι-NKX2-8 (1:100; LSBio Cat # LS-C31524-100) σε 20 φυσιολογικούς ιστούς μαστού και 344 δείγματα καρκίνου του μαστού, σύμφωνα με προηγούμενη αναφορά (12). Το σύστημα Axio Imager.Z2 (Carl Zeiss Co. Ltd., Jena, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για τη λήψη των εικόνων ανοσοϊστοχημείας. Ο βαθμός ανοσοχρώσης των σταθεροποιημένων με φορμαλίνη, ενσωματωμένων σε παραφίνη τομών εξετάστηκε και βαθμολογήθηκε χωριστά από δύο ανεξάρτητους παθολόγους τυφλούς ως προς τα ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά και τα δεδομένα ασθενών των δειγμάτων. Οι βαθμολογίες προσδιορίστηκαν συνδυάζοντας την αναλογία των θετικά χρωματισμένων καρκινικών κυττάρων και την ένταση της χρώσης. Οι βαθμολογίες που έδωσαν οι δύο ανεξάρτητοι παθολόγοι συνδυάστηκαν σε μια μέση βαθμολογία για περαιτέρω συγκριτική αξιολόγηση. Οι αναλογίες των καρκινικών κυττάρων βαθμολογήθηκαν ως εξής: 0, κανένα θετικό όγκο όγκου. 1, lt;10% θετικά κύτταρα όγκου. 2, 10–35% θετικά καρκινικά κύτταρα. 3, 35-75% θετικά καρκινικά κύτταρα. 4, gt;75% θετικά καρκινικά κύτταρα. Η ένταση της χρώσης βαθμολογήθηκε σύμφωνα με το ακόλουθο πρότυπο: 1, χωρίς χρώση. 2, αδύναμη χρώση (ανοιχτό κίτρινο). 3, μέτρια χρώση (κίτρινο καφέ). 4, ισχυρή χρώση (καφέ). Ο δείκτης χρώσης (SI) υπολογίστηκε ως το γινόμενο της βαθμολογίας έντασης χρώσης και της αναλογίας των θετικών κυττάρων όγκου. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο αξιολόγησης, αξιολογήσαμε την έκφραση πρωτεΐνης σε φυσιολογικούς ιστούς μαστού, ιστούς καρκίνου του μαστού και ιστούς οστικής μετάστασης προσδιορίζοντας το SI, με πιθανές βαθμολογίες 0, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 12, και 16. Δείγματα με SI ≥ 8 προσδιορίστηκαν ως υψηλή έκφραση και δείγματα με SI lt; 8 προσδιορίστηκαν ως χαμηλή έκφραση. Οι τιμές αποκοπής προσδιορίστηκαν με βάση ένα μέτρο ετερογένειας χρησιμοποιώντας τη δοκιμή λογαριθμικής κατάταξης σε σχέση με τη συνολική επιβίωση.

Σύστημα CAPTURE

Το σύστημα CAPTURE που χρησιμοποιεί το βιοτινυλιωμένο απενεργοποιημένο Cas9 (dCas9) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με προηγούμενη αναφορά (14). Εν συντομία, η πρωτεΐνη που σχετίζεται με τον γονιδιωματικό τόπο στα καρκινικά κύτταρα του μαστού διαμολύνθηκε με το σύστημα CAPTURE, συμπεριλαμβανομένου ενός FB-dCas9 και μιας λιγάσης βιοτίνης BirA (αγοράστηκε από Addgene, Watertown, MA, USA; 100547 και 100548) και ειδικού στόχου RNA απλού οδηγού (στοχεύοντας τον προαγωγέα της PTHrP, που παρατίθεται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 1), απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας καθαρισμό στρεπταβιδίνης και στη συνέχεια για ανάλυση φασματομετρίας μάζας.

Δοκιμασία Κυτταρικής Ανάπτυξης

Μια δοκιμασία βρωμιούχου 3-(4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ)-2, 5-διφαινυλτετραζολίου (ΜΤΤ) χρησιμοποιήθηκε για να εξεταστεί η κυτταρική ανάπτυξη. Εν συντομία, τα υποδεικνυόμενα κύτταρα (8 χ 103 ⁾ καλλιεργήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων στο υποδεικνυόμενο χρονικό σημείο, και 0,5 mg/mL ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για 4 ώρες. Στη συνέχεια αφαιρείται το MTT, προστίθεται διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και αναμειγνύεται ζωηρά. Ο SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices) χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της απορρόφησης στα 490nm.

Δοκιμασία Οστεοκλαστογένεσης

Πρόδρομα κύτταρα οστεοκλαστών (1 × 105 ⁾ καλλιεργήθηκαν σε συστάδες 24 φρεατίων που περιείχαν γυάλινες καλυπτρίδες (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) και αναπτύχθηκαν στο ρυθμισμένο μέσο (CM), μόνα τους ή υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αντίσωμα αντι-PTHrP (10 μg/mL), ή 6-TG (10 μΜ), ή PTHrP7-34 (0,5 μΜ). Τα μέσα αλλάζονταν κάθε δεύτερη μέρα. Οι οστεοκλάστες μετρήθηκαν την ημέρα 6. Οι οστεοκλάστες που καλλιεργήθηκαν σε πλαστικά πιάτα σταθεροποιήθηκαν με 4% αλατούχο διάλυμα παραφορμαλδεΰδης/φωσφορικού ρυθμιστικού διαλύματος (PBS) και όξινη φωσφατάση ανθεκτική σε τρυγικό άλας (TRAP) στα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ (387Α-1ΚΤ). Sigma-Aldrich). Τα θετικά σε TRAP πολυπύρηνα κύτταρα που περιέχουν gt; 3 πυρήνες ορίζονται ως οστεοκλάστες.

Μοντέλα Ξενομοσχευμένου Όγκου

Η μελέτη σε ζώα αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από την επιτροπή φροντίδας ζώων του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen. Η δοκιμασία οστικής μετάστασης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα κύτταρα καρκίνου του μαστού που εκφράζουν τη λουσιφεράση (1×105 ⁾ που εγχύθηκαν ενδοκαρδιακά σε nu/nu γυμνά ποντίκια (ηλικίας 5 εβδομάδων). Το αντίσωμα κατά της PTHrP (Abcam) ή η IgG κατά του κουνελιού χορηγήθηκαν ενδοπεριτοναϊκά δύο φορές την εβδομάδα. Το 6-TG (1,0 mg/kg σε 100 μL PBS) ή το PTHrP7-34 (200 μg/kg σε μL PBS) εγχύονταν υποδόρια καθημερινά. Το σύστημα μικρο-υπολογιστικής τομογραφίας (μCT) SIEMENS (SIEMENS, Μόναχο, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των οστεολυτικών βλαβών στην κνήμη και το μηριαίο οστό του οπίσθιου άκρου. Τα οστά των ποντικών συλλέχθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

In Vivo Ποσοτικοποίηση Οστεοκλαστών

Τα πίσω άκρα σταθεροποιήθηκαν σε διάλυμα παραφορμαλδεΰδης (4%), απασβεστοποιήθηκαν σε 14,3% EDTA για 4 ημέρες στους 37°C με ημερήσιες αλλαγές του EDTA και στη συνέχεια ενσωματώθηκαν σε κερί παραφίνης. Οι τομές χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη χρησιμοποιώντας διάλυμα αιματοξυλίνης Mayer, χρωματίστηκαν με TRAP (χρησιμοποιώντας κιτ TRAP, 387A-1KT, Sigma-Aldrich) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα του κατασκευαστή. Οι αριθμοί των οστεοκλαστών TRAP προσδιορίστηκαν σε μια ενδοφλοιώδη επιφάνεια μήκους 3 mm και εξετάστηκαν κάτω από ένα οπτικό μικροσκόπιο (Olympus, DP72, Τόκιο, Ιαπωνία).

Στατιστική

Όλα τα δεδομένα που παρουσιάστηκαν σε αυτή τη μελέτη παρουσιάστηκαν ως η μέση ± τυπική απόκλιση (SD) και το n αντιπροσωπεύει τον αριθμό των ανεξάρτητων πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν σε διαφορετικά ποντίκια ή διαφορετικές παρτίδες κυττάρων ή διαφορετικούς κλινικούς ιστούς. Η στατιστική ανάλυση διεξήχθη είτε με το Student’s two-tailed t-test είτε με μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Οι διμεταβλητές συσχετίσεις υπολογίστηκαν μεταξύ των μεταβλητών της μελέτης χρησιμοποιώντας τους συντελεστές συσχέτισης κατάταξης του Spearman. Οι καμπύλες επιβίωσης σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier. Χρησιμοποιήθηκε για τη γραφική απεικόνιση των καμπυλών επιβίωσης που συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή log-rank. Χρησιμοποιήθηκαν μονομεταβλητές και πολυμεταβλητές αναλύσεις παλινδρόμησης Cox για την ανάλυση της σημασίας διαφόρων μεταβλητών για την επιβίωση. Οι τιμές P που είναι μικρότερες από θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές. Το GraphPad Prism 7 (GraphPad Inc., La Jolla, CA, USA) και το SPSS 19.

Αποτελέσματα

Το μειωμένο NKX2-8 σχετίζεται με την εξέλιξη της οστικής μετάστασης στον καρκίνο του μαστού

Η κυτταρική σειρά SCP2, η οποία είναι η κυτταρική γραμμή οστικού τροπισμού που προέρχεται από κύτταρα MDA-MB-231, χρησιμοποιείται για τη μελέτη του οστικού τροπισμού της μετάστασης του καρκίνου του μαστού (15). Για τον έλεγχο των βασικών παραγόντων που εμπλέκονται στη μετάσταση των οστών του καρκίνου του μαστού, διεξήχθη πρωτεομική με βάση την MS σε γονικά κύτταρα SPC2 και MDA-MB-231. Η ανάλυση του προφίλ πρωτεϊνών έδειξε ότι ένα σύνολο 34 πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων 18 αυξημένων πρωτεϊνών και 16 μειωμένων πρωτεϊνών, απορυθμίστηκαν στα κύτταρα SPC2 σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα MDA-MB-231 (Εικόνα 1Α και Συμπληρωματικός Πίνακας 2). Μεταξύ αυτών, τα επίπεδα NKX2-8 βρέθηκαν να είναι σημαντικά μειωμένα στους μεταστατικούς ιστούς των οστών σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς του μαστού ή τους μη μεταστατικούς ιστούς καρκίνου του μαστού, αντίστοιχα (Εικόνες 1Β, Γ και Συμπληρωματικό Σχήμα 1). Επί πλέον, Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι οι ασθενείς με καρκίνο μαστού υψηλής έκφρασης NKX2-8 είχαν πολύ μεγαλύτερη επιβίωση χωρίς μετάσταση στα οστά από τους ασθενείς με καρκίνο μαστού χαμηλής έκφρασης NKX2-8 (P = 0,011 και Εικόνα 1D). Συνολικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μειωμένη NKX2-8 συνδέεται με την ανάπτυξη οστικής μετάστασης στον καρκίνο του μαστού.

Εικόνα 1 Το NKX2-8 σχετίζεται με την εξέλιξη της οστικής μετάστασης στον καρκίνο του μαστού. (Α) Οι ρυθμισμένες προς τα πάνω και προς τα κάτω ρυθμισμένες πρωτεΐνες σε κύτταρα SCP2 σε σύγκριση με κύτταρα MDA-MB-231 αναλύθηκαν με τη χρήση γραφικής παράστασης Volcano. (B, C) Αντιπροσωπευτικές εικόνες IHC (B) και ποσοτικοποίηση (C) του επιπέδου NKX2-8 σε φυσιολογικό ιστό μαστού (n = 20), πρωτοπαθείς μη οστικούς μεταστατικούς ιστούς καρκίνου του μαστού (n = 241), πρωτοπαθή οστό-μεταστατικό μαστό καρκινικούς ιστούς (n = 63) και ιστούς καρκίνου του μαστού με μεταστατικό οστό (n = 40). Μπάρα κλίμακας, 50 μm. (ΡΕ)Ανάλυση Kaplan-Meier των καμπυλών επιβίωσης χωρίς οστικές μεταστάσεις σε ασθενείς με καρκίνο μαστού υψηλής έναντι χαμηλής έκφρασης NKX2-8 με οστική μετάσταση (n = 63, P = 0,011, log-rank test). Το *** σημαίνει P lt; 0,001, το NS σημαίνει μη σημαντικό (P gt; 0,05).

Το NKX2-8 καταστέλλει την οστική μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του μαστού

Ο βιολογικός ρόλος του NKX2-8 στη μετάσταση ειδικού οργάνου καρκίνου του μαστού εξετάστηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού MDA-MB-231 με NKX2-8-sililed SCP-2 και NKX2-8-υπερεκφράζοντας MDA-MB-231 (Εικόνα 2Α) και στη συνέχεια εγχύθηκαν ενδοκαρδιακά τα αντίστοιχα κύτταρα σε γυμνά ποντίκια. Τα ποντίκια στα οποία έγινε ένεση με κύτταρα καρκίνου του μαστού που είχαν σιγήσει NKX2-8 εμφάνισαν προηγούμενες οστικές μεταστάσεις, όπως αποκαλύφθηκε από την ανάλυση μCT και την ιστολογική εξέταση (Εικόνες 2B, C). Συνεπώς, σε σύγκριση με αυτό στα ποντίκια ελέγχου, τα καρκινικά κύτταρα του μαστού που υπερεκφράζουν NKX2-8 εμφάνισαν καθυστερημένες οστικές μεταστάσεις και μειωμένες βλάβες οστικής μετάστασης/οστεολυτικές περιοχές (Εικόνες 2Β, Γ). Η ιστολογική χρώση TRAP έδειξε ότι τα καρκινικά κύτταρα του μαστού που υπερεκφράζουν NKX2-8 κατέστειλαν σημαντικά την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών (Εικόνα 2C). Συλλογικά,

Εικόνα 2 Η σίγαση NKX2-8 προάγει την οστική μετάσταση στον καρκίνο του μαστού. (Α) Ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου της έκφρασης NKX2-8 σε κύτταρα SCP2 που έχουν μετατραπεί με sh-φορέα και NKX2-8-shRNA(s) και σε κύτταρα MDA-MB-231 που έχουν μετατραπεί από φορέα και NKX2-8. Το GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Αριστερά: εικόνες μCT οστικών βλαβών από αντιπροσωπευτικά ποντίκια. Δεξιά: Ποσοτικοποίηση της περιοχής οστεολυτικής βλάβης μCT και καμπύλη επιβίωσης χωρίς οστικές μεταστάσεις Kaplan-Meier των υποδεικνυόμενων ομάδων ποντικών σε πειραματική φάση μετάστασης (n = 8/ομάδα). (ΝΤΟ)Ιστολογικές εικόνες Hamp;E (αριστερά-επάνω) και εικόνες TRAP (αριστερά-κάτω), και ποσοτικοποίηση (δεξιά) της οστεολυτικής περιοχής και των θετικών σε TRAP οστεοκλαστών όπως φαίνεται στα υποδεικνυόμενα ποντίκια (n = 8/ομάδα). Μπάρα κλίμακας, 50 μm. π.Χ., Καρκίνος του μαστού; ΒΜ, Οστική Μετάσταση. * σημαίνει P lt; 0,05, *** σημαίνει P lt; 0,001.

Η μείωση της PTHrP που προκαλείται από NKX2-8 προάγει την οστεοκλαστογένεση

Είναι ενδιαφέρον ότι, παρόμοια με τη θεραπεία με τα ρυθμισμένα μέσα (CM) από κύτταρα ελέγχου, δεν υπήρξε καμία επίδραση στην οστεοκλαστογένεση όταν οι οστεοκλάστες υποβλήθηκαν σε αγωγή απευθείας με εκείνη των κυττάρων που είχαν σιγήσει με NKX2-8 (Εικόνα 3Α). Παρ’ όλα αυτά, το CM από οστεοβλάστες βρέθηκε ότι αυξάνει σημαντικά τον αριθμό των θετικών σε TRAP πολυπύρηνων οστεοκλαστών και ενισχύει την ενζυματική δραστηριότητα TRAP, όταν οι οστεοβλάστες υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με CM από σιγασμένα με NKX2-8 κύτταρα (Εικόνα 3Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το CM από κύτταρα σιγασμένα με NKX2-8 προάγει έμμεσα την οστεοκλαστογένεση. Λαμβάνοντας υπόψη ότι ο άξονας RANKL/OPG είναι ζωτικής σημασίας για την οστεοκλαστογένεση, στη συνέχεια εξετάσαμε την αναλογία RANKL/OPG στους οστεοβλάστες υπό επαγωγή από CM από καρκινικά κύτταρα μαστού. Η σχετική αναλογία RANKL/OPG αυξήθηκε δραματικά μετά από θεραπεία με CM από σιγασμένα με NKX2-8 κύτταρα, αλλά μειώθηκε μετά από θεραπεία με CM από κύτταρα που υπερεκφράζουν το NKX2-8 (Εικόνα 3Β). Συνεπώς, η έκφραση του δείκτη διαφοροποίησης και ο δείκτης ενεργοποίησης των οστεοκλαστών, όπως οι Acp5, Ctsk, Nfat-c1, C-fos και Dc-stamp, ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω σε οστεοκλάστες που έλαβαν CM από οστεοβλάστες που υποβλήθηκαν σε προηγούμενη θεραπεία με CM από NKX2-8 -Σίγασε τα καρκινικά κύτταρα του μαστού, αλλά μειώθηκε ως απόκριση στην υπερέκφραση του NKX2-8 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το NKX2-8 σίγασης που προκαλείται από έκκριμα προάγει την οστεοκλαστογένεση μέσω του RANKL που εκκρίνεται από οστεοβλάστες. ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω σε οστεοκλάστες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CM από οστεοβλάστες που έλαβαν εκ των προτέρων θεραπεία με CM από σιγασμένα με NKX2-8 κύτταρα καρκίνου του μαστού, αλλά μειώθηκαν ως απόκριση στην υπερέκφραση του NKX2-8 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το NKX2-8 σίγασης που προκαλείται από έκκριμα προάγει την οστεοκλαστογένεση μέσω του RANKL που εκκρίνεται από οστεοβλάστες. ρυθμίστηκαν σημαντικά προς τα πάνω σε οστεοκλάστες που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CM από οστεοβλάστες που έλαβαν εκ των προτέρων θεραπεία με CM από σιγασμένα με NKX2-8 κύτταρα καρκίνου του μαστού, αλλά μειώθηκαν ως απόκριση στην υπερέκφραση του NKX2-8 (Συμπληρωματικό Σχήμα 2). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το NKX2-8 σίγασης που προκαλείται από έκκριμα προάγει την οστεοκλαστογένεση μέσω του RANKL που εκκρίνεται από οστεοβλάστες.

Σχήμα 3 Η PTHrP που προκαλείται από σίγαση NKX2-8 προάγει την οστεοκλαστογένεση in vitro. (Α) Αριστερά: σχηματική απεικόνιση της οστεοκλαστογένεσης υπό θεραπεία με CM από καρκινικά κύτταρα μαστού ή από οστεοβλάστες που έχουν υποβληθεί σε προεπεξεργασία με CM από καρκινικά κύτταρα μαστού. Μέση: προσδιορισμοί διαφοροποίησης οστεοκλαστών που αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας καλλιέργεια CM χρώσης TRAP που ελήφθη από τα υποδεικνυόμενα κύτταρα. Δεξιά: Ποσοτικοποίηση του αριθμού των θετικών σε TRAP πολυπυρηνικών οστεοκλαστών και της δραστηριότητας TRAP. (Β) Ανάλυση ELISA της αναλογίας RANKL/OPG σε CM από πρόδρομα κύτταρα οστεοβλαστών κύτταρα MC3T3-E1 που καλλιεργήθηκαν στο CM που ελήφθη από τα υποδεικνυόμενα κύτταρα καρκίνου του μαστού. (ΝΤΟ)Ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο που υποδεικνύει έκφραση ρυθμιστή οστεοκλαστογένεσης στα υποδεικνυόμενα κύτταρα. Το ψευδόχρωμο αντιπροσωπεύει την κλίμακα έντασης των γονιδίων στα υποδεικνυόμενα κύτταρα που δημιουργούνται από έναν μετασχηματισμό log2. Το GAPDH χρησιμεύει ως έλεγχος φόρτωσης. (D) Ανάλυση ELISA των εκκρινόμενων επιπέδων PTHrP σε CM από τα υποδεικνυόμενα κύτταρα. (Ε) Ανάλυση PCR πραγματικού χρόνου των επιπέδων PTHrP σε κύτταρα MDA-MB-231/NKX2-8 sh#1 που έχουν μετατραπεί με sh-φορέα και PTHrP-shRNA(s). Το GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (ΦΑ)Αριστερά: σχηματική απεικόνιση της οστεοκλαστογένεσης υπό θεραπεία με CM από οστεοβλάστες που έχουν υποβληθεί σε προηγούμενη αγωγή με CM από καρκινικά κύτταρα μαστού. Δεξιά: Ανάλυση ELISA της αναλογίας RANKL/OPG σε CM από πρόδρομα κύτταρα οστεοβλαστών κύτταρα MC3T3-E1 παρουσία CM από τα υποδεικνυόμενα κύτταρα καρκίνου του μαστού και ποσοτικοποίηση του αριθμού των θετικών σε TRAP πολυπύρηνων οστεοκλαστών και της δραστικότητας TRAP που καλλιεργήθηκαν στο CM. από τα υποδεικνυόμενα κελιά. (Ζ) Αριστερά: σχηματική απεικόνιση του «φαύλου κύκλου» που προκαλείται από τον καρκίνο του μαστού μεταξύ των υποδεικνυόμενων κυττάρων. Μέση: Τα επίπεδα του TGF-β1 που αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ELISA σε CM από κύτταρα RAW 264.7 που καλλιεργήθηκαν πάνω στη φέτα οστού σε CM που ελήφθη από τα καρκινικά κύτταρα του μαστού. Δεξιά: Ανάλυση δοκιμασίας ΜΤΤ του ρυθμού πολλαπλασιασμού των υποδεικνυόμενων κυττάρων από το πείραμα στο αριστερό πλαίσιο. (Η)Σχηματική απεικόνιση του «φαύλου κύκλου» που προκαλείται από PTHrP μεταξύ των υποδεικνυόμενων κυττάρων. π.Χ.: Καρκίνος του μαστού. NS σημαίνει μη σημαντικό (P gt; 0,05), *** σημαίνει P lt; 0,001.

Μεταξύ των ρυθμιστών οστεοκλαστογένεσης που έχουν αναφερθεί προηγουμένως (16-19), η PTHrP ήταν μια από τις πιο ρυθμιζόμενες εκκρινόμενες πρωτεΐνες σε NKX2-8 σιγασμένα κύτταρα, αλλά ήταν μειωμένη σε κύτταρα που υπερέκφραζαν NKX2-8 (Εικόνα 3C). Συνεπώς, τα επίπεδα της εκκρινόμενης πρωτεΐνης PTHrP μειώθηκαν επίσης δραστικά σε κύτταρα υπερεκφρασμένα με NKX2-8, αλλά αυξημένα σε κύτταρα σιγασμένα με NKX2-8, (Εικόνα 3D), υποδηλώνοντας τον πιθανό ρόλο της PTHrP στη μετάσταση των οστών του καρκίνου του μαστού.

Η αποσιώπηση της PTHrP ακύρωσε την επαγωγή έκκρισης RANKL με σιωπή NKX2-8, τον αριθμό πολυπύρηνων οστεοκλαστών που είναι θετικοί στο TRAP, την ενζυματική δραστηριότητα του TRAP (Εικόνες 3Ε, ΣΤ), που έδειξε ότι η επαγόμενη από τη σίγαση NKX2-8-PTHrP προάγει την οστεοκλαστογένεση της οστεοκλαστογένεσης από την PTHrP . Επιπλέον, ο φαύλος κύκλος που προάγεται από τη σίγαση NKX2-8 αποκλείστηκε σημαντικά από τη σίγαση της PTHrP, όπως υποδεικνύεται από τη μείωση της ρύθμισης του TGF-β που απελευθερώνεται από τη μήτρα των οστών και τους μειωμένους ρυθμούς ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του μαστού (Εικόνα 3G). Συνολικά, τα αποτελέσματά μας έδειξαν έντονα έναν κρίσιμο ρόλο του άξονα NKX2-8/PTHrP/RANKL στη ρύθμιση της οστεοκλαστογένεσης in vivo, που οδήγησε σε έναν φαύλο κύκλο μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και των οστεοκλαστών (Εικόνα 3Η).

Το NKX2-8 καταστέλλει μεταγραφικά την έκφραση της PTHrP

Στη συνέχεια, εξετάστηκε ο ρόλος της μείωσης του NKX2-8 στην έκφραση της PTHrP. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, τα αποτελέσματα της δοκιμασίας NKX2-8 ChIP υποδηλώνουν ότι το NKX2-8 συσχετίστηκε σημαντικά με τον προαγωγέα PTHrP σε κύτταρα MDA-MB-231. Επιπλέον, τα NKX2-8 σιγασμένα κύτταρα που εμφανίστηκαν αυξήθηκαν, αλλά τα κύτταρα που υπερέκφραζαν το NKX2-8 παρουσίασαν μειωμένα, οι δραστηριότητες λουσιφεράσης των γονιδίων με ειδική θέση δέσμευσης NKX2-8 (NBS) (Εικόνα 4Β). Ενώ, δεν παρατηρήσαμε την επίδραση στις δραστηριότητες λουσιφεράσης του προαγωγέα που έχει διαγραφεί με NKX2-8 NBS (Εικόνα 4Β). Η αντίστροφη συσχέτιση του NKX2-8 με την έκφραση PTHrP καταδείχθηκε επίσης χρησιμοποιώντας ανάλυση IHC σε ιστούς καρκίνου του μαστού, η οποία έκφραση NKX2-8 σχετίστηκε αρνητικά με το επίπεδο PTHrP (Εικόνα 4C). Σημαντικό, δεν βρέθηκε συσχέτιση του NKX2-8 και της PTHrP στους ιστούς του καρκίνου του μαστού με τη μετάσταση σε άλλα όργανα (Συμπληρωματικό Σχήμα 3). Η ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο αποκάλυψε ότι η έκφραση PTHrP μειώθηκε στον μαστό με υψηλή έκφραση NKX2-8 αλλά ρυθμίστηκε προς τα πάνω στον NKX2-8 χαμηλής έκφρασης (Εικόνα 4D). Επομένως, αυτά τα αποτελέσματα παρείχαν περαιτέρω στοιχεία ότι η μεταγραφή NKX2-8 ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση της PTHrP μέσω απευθείας στόχευσης στους προαγωγείς της.

Σχήμα 4 Το NKX2-8 καταστέλλει μεταγραφικά την PTHrP. (Α) Ανάλυση ChIP του εμπλουτισμού του NKX2-8 στον προαγωγέα του γονιδίου PTHrP σε κύτταρα MDA-MB-231. (Β) Σχετικές δραστηριότητες λουσιφεράσης του προαγωγέα PTHrP στα ενδεικνυόμενα καρκινικά κύτταρα μαστού. (Γ) Τα επίπεδα NKX2-8 συσχετίστηκαν αρνητικά με την έκφραση της PTHrP σε ιστούς καρκίνου του μαστού (n = 304). Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες χρώσης IHC (αριστερά) και η συσχέτιση έκφρασης (δεξιά) της πρωτεΐνης NKX2-8 και PTHrP σε ιστούς καρκίνου του μαστού. Ράβδοι κλίμακας, 20 μm. (Δ) Σχετική έκφραση NKX2-8 και PTHrP σε ιστούς πρωτοπαθούς καρκίνου του μαστού (n = 20) με οστική μετάσταση (n = 10, P lt; 0,001). ** σημαίνει P lt; 0,01., *** σημαίνει P lt; 0,001 NS σημαίνει μη σημαντικό (P gt; 0,05).

Το σύμπλεγμα NKX2-8/HDAC1 εμπλέκεται στην έκφραση PTHrP με αναστολή NKX2-8

Προκειμένου να διερευνήσουμε τον μοριακό μηχανισμό στον οποίο η μεταγραφική καταστολή της PTHrP με τη μεσολάβηση NKX2-8, πραγματοποιήσαμε την ανάλυση σύλληψης βιοτινυλιωμένου απενεργοποιημένου Cas9 (dCas9) και βρήκαμε ότι τόσο το NKX2-8 όσο και το HDAC1 ταυτοποιήθηκαν ότι στοχεύουν στον προαγωγέα PTHrP στο MDA- Κύτταρα MB-231 (Εικόνα 5Α και Συμπληρωματικός Πίνακας 3). Επιπλέον, οι αναλύσεις ChIP αποκάλυψαν ότι η προς τα κάτω ρύθμιση του NKX2-8 μείωσε σημαντικά, ενώ η ανοδική ρύθμιση του NKX2-8 εμπλούτισε το επίπεδο HDAC1 στον προαγωγέα PTHrP στα καρκινικά κύτταρα του μαστού (Εικόνα 5Β). Αντίθετα, η σίγαση του NKX2-8 αυξήθηκε δραστικά, αλλά η υπερέκφραση του NKX2-8 μειώθηκε, ο εμπλουτισμός της ακετυλίωσης H3K27 (H3K27ac) στον υποκινητή του γονιδίου PTHrP στα καρκινικά κύτταρα του μαστού (Εικόνα 5C), γεγονός που έδειξε ότι το NKX2-8 ανέστειλε την έκφραση της PTHrP μέσω για τη μείωση του H3K27ac στον υποκινητή της PTHrP. Εν τω μεταξύ, Η σίγαση HDAC1 αύξησε σημαντικά την έκφραση PTHrP σε κύτταρα υπερέκφρασης NKX2-8 (Εικόνα 5D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το HDAC1 έπαιξε σημαντικό ρόλο στην έκφραση της PTHrP που προκαλείται από NKX2-8. Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, βρήκαμε ότι η καταστροφή του HDAC1 δεν έχει καμία επίδραση στον εμπλουτισμό του NKX2-8, αλλά αύξησε σημαντικά το επίπεδο του H3K27ac, στον υποκινητή PTHrP (Εικόνες 5E–G), το οποίο υποστήριξε περαιτέρω την ιδέα ότι το NKX2- 8 αναστέλλει την έκφραση της PTHrP μέσω HDAC1 για να μειώσει το H3K27ac στον υποκινητή της PTHrP.

Σχήμα 5 Το NKX2-8 αλληλεπιδρά με το HDAC1 στη μεταγραφή PTHrP που αναστέλλεται με NKX2-8. (Α) Σχηματικό διάγραμμα αλληλεπίδρασης μεταξύ του NKX2-8 και του HDAC1 στον προαγωγέα PTHrP χρησιμοποιώντας την προσέγγιση CAPATURE. (Β) Ανάλυση ChIP του εμπλουτισμού HDAC1 στον προαγωγέα PTHrP στα ενδεικνυόμενα καρκινικά κύτταρα μαστού. (Γ) Ανάλυση ChIP του εμπλουτισμού του H3K27ac στον προαγωγέα PTHrP στα ενδεικνυόμενα καρκινικά κύτταρα του μαστού. (Δ) Ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο του mRNA του PTHrP (αριστερά) και ανάλυση ELISA της έκφρασης PTHrP ορού (δεξιά) στα υποδεικνυόμενα κύτταρα. Το GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Ε) Η σχετική έκφραση του HDAC1 στα υποδεικνυόμενα κύτταρα χρησιμοποιώντας ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο. Το GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης.(ΣΤ) Ανάλυση ChIP της συσχέτισης του NKX2-8 με τον προαγωγέα του γονιδίου PTHrP στα ενδεικνυόμενα καρκινικά κύτταρα μαστού. (Ζ) Ο σχετικός εμπλουτισμός του H3K27ac στον προαγωγέα PTHrP προσδιορίστηκε με ανάλυση ChIP στα ενδεικνυόμενα καρκινικά κύτταρα του μαστού. NS σημαίνει μη σημαντικό (P gt; 0,05), *** σημαίνει P lt; 0,001.

Με συνέπεια, η αποσιώπηση του HDAC1 στα καρκινικά κύτταρα του μαστού κατήργησε σημαντικά την αναγωγική επίδραση του NKX2-8 στον σχηματισμό πολυπυρηνικών οστεοκλαστών TRAP και την ενζυματική δραστηριότητα TRAP (Εικόνες 6Α, Β). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το σύμπλεγμα καταστολέα NKX2-8/HDAC1 εμπλέκεται στην ανασταλμένη από NKX2-8 έκφραση PTHrP σε καρκινικά κύτταρα μαστού.

Σχήμα 6 Το NKX2-8 καταστέλλει την οστεοκλαστογένεση μέσω HDAC1. (Α) Εικόνες χρώσης TRAP των υποδεικνυόμενων προοστεοκλαστών που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CM. Μπάρα κλίμακας, 20μm ή 50μm. (Β) Η ποσοτικοποίηση του αριθμού των TRAP-θετικών πολυπυρηνικών κυττάρων και η εξέταση της δραστικότητας TRAP. *** σημαίνει P lt; 0,001.

Η στόχευση της PTHrP αναστέλλει την οστεοκλαστογένεση και τη μετάσταση των οστών που προκαλείται από σίγαση NKX2-8

Για να προσδιοριστεί η κρίσιμη επίδραση της προερχόμενης από όγκο PTHrP στην οστεοκλαστογένεση που προκαλείται από σίγαση NKX2-8, τα πρόδρομα κύτταρα οστεοκλαστών υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τρεις τύπους αναστολέων PTHrP, συμπεριλαμβανομένου του πεπτιδικού ανταγωνιστή PTHrP7-34, του εξουδετερωτικού αντισώματος και του χημικού αναστολέα 6-θειογουανίνη (6-TG), υπό συνθήκες CM από σιγασμένα κύτταρα ΝΚΧ2-8. Οι αναλύσεις οστεοκλαστογένεσης έδειξαν ότι και οι τρεις τύποι αναστολέων μείωσαν αποτελεσματικά τα αποτελέσματα οστεοκλαστογένεσης του CM από NKX2-8 σιγασμένα κύτταρα, καθώς η αναστολή PTHrP καταργούσε πλήρως τις επαγόμενες επιδράσεις της σίγασης NKX2-8 στη θετική TRAP πολυπυρηνική δραστηριότητα οστεοκλαστών και TRAP ( Σχήματα 7A–C). Αυτά τα αποτελέσματα υποστήριξαν περαιτέρω την ιδέα ότι το NKX2-8 ανέστειλε την οστεοκλαστογένεση μέσω PTHrP in vitro. Εξάλλου, Βρήκαμε ότι η θεραπεία και με τους τρεις αναστολείς PTHrP εμφάνισε δραματική μπλοκαρισμένη επίδραση στον φαύλο κύκλο που προκαλείται από τη σίγαση του NKX2-8, όπως υποδεικνύεται από το μειωμένο επίπεδο του TGF-β1 που απελευθερώνεται από τη μήτρα των οστών και τους βραδύτερους ρυθμούς ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του μαστού (Συμπληρωματικό Σχήμα 4). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η στόχευση της PTHrP συμβάλλει στην αναστολή της οστεοκλαστογένεσης και του φαύλου κύκλου που προκαλείται από τη σίγαση NKX2-8.

Εικόνα 7 Η στόχευση της PTHrP αναστέλλει την οστική μετάσταση που προκαλείται από τη σίγαση NKX2-8. (Α) Σχηματική απεικόνιση της οστεοκλαστογένεσης στην υποδεικνυόμενη κατάσταση. (Β) Δοκιμασίες διαφοροποίησης οστεοκλαστών που αναλύθηκαν όπως φαίνεται με χρώση TRAP των υποδεικνυόμενων προ-οστεοκλαστών που υποβλήθηκαν σε αγωγή με CM με προσθήκη PBS ή PTHrP7-34, IgG ή αντισώματος αντι-PTHrP ή φορέα ή 6-TG. (Γ) Ποσοτικοποίηση του αριθμού των θετικών σε TRAP πολυπυρηνικών κυττάρων (άνω) και εξέταση της δραστικότητας TRAP (κάτω). (D) εικόνες μCT οστικών βλαβών από ποντίκια που έλαβαν ένεση MDA-MB-231/NKX2-8 sh#1 και υποβλήθηκαν σε θεραπεία με PBS ή PTHrP7-34 ή IgG ή αντίσωμα ή φορέα αντι-PTHrP ή 6-TG. (Ε, ΣΤ)Ομαλοποιημένα σήματα BLI ποσοτικοποίησης οστικών μεταστάσεων της περιοχής οστεολυτικής βλάβης μCT (E) και καμπύλης επιβίωσης χωρίς μετάσταση οστών Kaplan-Meier (F) των υποδεικνυόμενων ποντικών στην πειραματική φάση μετάστασης (n = 8/ομάδα). *** σημαίνει P lt; 0,001.

Ενέσαμε NKX2-8 σιγασμένα κύτταρα MDA-MB-231 ενδοκαρδιακά σε γυμνά ποντίκια και τα αντιμετωπίσαμε με PTHrP7-34 ή αντίσωμα anti-PTHrP ή 6-TG, το οποίο κατέστειλε σημαντικά τα σήματα οστικής μετάστασης και την οστική καταστροφή, όπως παρακολουθήθηκε με ανάλυση μCT. Εικόνα 7D). Συνεπώς, σε σύγκριση με τα ποντίκια ελέγχου, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με PTHrP7-34 ή αντίσωμα anti-PTHrP ή 6-TG δεν εμφάνισαν οστικές μεταστάσεις και βλάβες οστικής μετάστασης/οστεολυτικές περιοχές (Εικόνες 7Ε, ΣΤ). Συλλογικά, τα δεδομένα μας καταδεικνύουν ότι η στόχευση της PTHrP ανέστειλε την οστεοκλαστογένεση και τη μετάσταση των οστών που προκαλείται από τη σίγαση NKX2-8.

Συζήτηση

Ως η πιο διαδεδομένη μορφή μετάστασης, η οστική μετάσταση εμφανίζεται πάνω από το 70% των ασθενών με καρκίνο του μαστού με προχωρημένες ασθένειες (20). Μπορεί να προκαλέσει πόνο στα οστά, οστεοπόρωση, παθολογικά κατάγματα και άλλα συμβάντα που σχετίζονται με τον σκελετό, τα οποία μειώνουν σημαντικά την ποιότητα ζωής του ασθενούς και μπορεί να είναι ακόμη και θανατηφόρα (4, 21). Η έκβαση του καρκίνου του μαστού με οστική μετάσταση είναι εξαιρετικά φτωχή, με ποσοστό επιβίωσης 1 έτους σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού μόνο 40-59% (22). Αν και οι τρέχουσες θεραπευτικές μέθοδοι, συμπεριλαμβανομένης της χημειοακτινοθεραπείας και των αντιοστεολυτικών φαρμάκων, έχουν βελτιώσει σημαντικά τη μείωση του ποσοστού εμφάνισης που σχετίζεται με οστική μετάσταση, αυτές οι θεραπείες παρέχουν μόνο ελάχιστο όφελος στην επιβίωση των ασθενών (4). Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη νέων αποτελεσματικών θεραπευτικών στρατηγικών για τη θεραπεία ασθενών με οστική μετάσταση καρκίνου του μαστού είναι επείγουσα. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι η πρωτεΐνη PTHrP που προκαλείται από τη σίγαση NKX2-8 παίζει ζωτικό ρόλο στην οστική μετάσταση του καρκίνου του μαστού προάγοντας την οστεοκλαστογένεση. Είναι σημαντικό ότι η στόχευση της PTHrP μείωσε σημαντικά την οστεοκλαστογένεση και κατέστειλε αποτελεσματικά την εξέλιξη της οστικής μετάστασης του καρκίνου του μαστού. Ως εκ τούτου, αυτά τα ευρήματα ρίχνουν φως σε έναν πιθανό μηχανισμό που κρύβεται πίσω από την οστική μετάσταση του καρκίνου του μαστού και μπορεί να αντιπροσωπεύει μια πιθανή κλινική στρατηγική για τη θεραπεία της οστικής μετάστασης του καρκίνου του μαστού.

Τα καρκινικά κύτταρα του μαστού έχουν την ικανότητα της «οργανοτροπικής μετάστασης», δηλαδή, προτιμώμενης μετάστασης σε συγκεκριμένα όργανα, η οποία ρυθμίζεται από υποτύπους καρκίνου του μαστού, στους οποίους η προμεταστατική θέση που προκαλείται από όγκο παίζει ζωτικό ρόλο στη μεταμόσχευση και την επιβίωση των μεταστατικών κυττάρων. (23). Έχει αναφερθεί ότι μόνο ένα πολύ μικρό κλάσμα των καρκινικών κυττάρων του μαστού έχει την ικανότητα να σχηματίζει εξαιρετικά επιθετικές, οστεολυτικές οστικές μεταστάσεις. Έτσι, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα SCP2 και MDA-MB-231, μια παράγωγη κυτταρική σειρά οστεοτροπισμού που απομονώθηκε από τους Yibin Kang et al. (15). Βρήκαμε ότι τα επίπεδα NKX2-8 μειώθηκαν σημαντικά στα κύτταρα SCP2 σε σύγκριση με εκείνα στα γονικά κύτταρα MDA-MB-231. Μεταγενέστερα πειράματα αποκάλυψαν μια ειδική για όργανο συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης NKX2-8 και της οστικής μετάστασης. Σημαντικό, τα ευρήματά μας έδειξαν ότι η σίγαση του NKX2-8 στα καρκινικά κύτταρα του μαστού επηρέασε την ικανότητά τους να επηρεάζουν την προμεταστατική θέση. Η σίγαση του NKX2-8 στα καρκινικά κύτταρα του μαστού ενεργοποίησε τη μεταγραφή PTHrP. Κατά συνέπεια, η PTHrP που προέρχεται από NKX2-8 αποσιωπημένα καρκινικά κύτταρα μαστού συμβάλλει στον σχηματισμό μεταστατικής θέσης προ των οστών μέσω της αλλαγής της αναλογίας RANKL/OPG μέσω δράσης στους οστεοβλάστες, με αποτέλεσμα την υποκίνηση οστεοκλαστογένεσης που οδήγησε σε μεταστατική οστική καταστροφή.

Ο NKX2-8 είναι ένας μεταγραφικός παράγοντας που συμμετέχει στην εξέλιξη ή τη χημειοανθεκτικότητα σε πολλαπλούς όγκους (7-13). Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το NKX2-8 παίζει κρίσιμο ρόλο στη μετάσταση στα οστά του καρκίνου του μαστού. Συγκεκριμένα, το NKX2-8 αλληλεπιδρά με το HDAC1 για να σχηματίσει ένα σύμπλεγμα που καταστέλλει τη μεταγραφή PTHrP σε καρκινικά κύτταρα του μαστού χωρίς μετάσταση στα οστά, ενώ η σίγαση του NKX2-8 θα μπορούσε να εξαλείψει την αναστολή της οστικής μετάστασης. Τα αποτελέσματά μας παρείχαν ένα νέο παράδειγμα για το NKX2-8 στον καρκίνο, ειδικά στη μετάσταση στα οστά, στο οποίο συμμετείχε στην αναμόρφωση του μικροπεριβάλλοντος των οστών και στην ενίσχυση της μετάστασης.

Συνολικά, τα παρόντα δεδομένα που παρέχονται στην τρέχουσα μελέτη υποδεικνύουν μια πιθανή θεραπευτική εφαρμογή αναστολέων PTHrP για τη θεραπεία και την πρόληψη της μείωσης της ρύθμισης της μετάστασης των οστών του καρκίνου του μαστού που προκαλείται από NKX2-8.

Δήλωση διαθεσιμότητας δεδομένων

Οι πρωτότυπες συνεισφορές που παρουσιάζονται στη μελέτη περιλαμβάνονται στο άρθρο/Συμπληρωματικό Υλικό. Περαιτέρω έρευνες μπορούν να απευθύνονται στους αντίστοιχους συγγραφείς.

Δήλωση Δεοντολογίας

Η μελέτη σε ζώα αναθεωρήθηκε και εγκρίθηκε από την επιτροπή φροντίδας ζώων του Πανεπιστημίου Sun Yat-sen.

Συνεισφορές Συγγραφέων

Η ΑΑ σχεδίασε τα πειράματα και ανέλυσε δεδομένα. Η ΥΗ πραγματοποίησε in vitro κυτταρικές μελέτες. Η SC πραγματοποίησε τα πειράματα όγκων ξενομοσχεύματος. Ο WQ πραγματοποίησε χρώση, ανοσοϊστοχημική και παθολογική ανάλυση. Η XL πραγματοποίησε το CHIP, την PCR πραγματικού χρόνου, την ανοσοκατακρήμνιση και την κηλίδα western. Το ΥΧ ανέλυσε δεδομένα φασματομετρίας μάζας. Οι LS, SZ και JL επέβλεψαν ολόκληρη τη μελέτη και έγραψαν την εργασία. Όλοι οι συγγραφείς συνέβαλαν στο άρθρο και ενέκριναν την υποβληθείσα έκδοση.

Χρηματοδότηση

Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ. 82030078, 81830082, 82072609, 81621004 και 82003128).

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.

Σημείωση εκδότη

Όλοι οι ισχυρισμοί που εκφράζονται σε αυτό το άρθρο είναι αποκλειστικά εκείνοι των συγγραφέων και δεν αντιπροσωπεύουν απαραιτήτως αυτούς των συνδεδεμένων οργανισμών τους ή του εκδότη, των εκδοτών και των κριτικών. Οποιοδήποτε προϊόν μπορεί να αξιολογηθεί σε αυτό το άρθρο ή ισχυρισμός που μπορεί να προβληθεί από τον κατασκευαστή του, δεν είναι εγγυημένο ή εγκεκριμένο από τον εκδότη.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον καθηγητή Guohong Hu της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών και της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Jiao Tong της Σαγκάης για την ευγενική παροχή των κυτταρικών σειρών SCP2. Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τους γηγενείς αγγλόφωνους επιστήμονες της Elixigen Company (Huntington Beach, Καλιφόρνια) για την επεξεργασία του χειρογράφου μας.

Συμπληρωματικό υλικό

Το συμπληρωματικό υλικό για αυτό το άρθρο βρίσκεται στο διαδίκτυο στη διεύθυνση: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fonc.2022.907000/full#supplementary-material

Συνείδηση, Διαταραχές συνείδησης, μέτρα συνείδησης, νευρικές συσχετίσεις συνείδησης, Τεχνητή συνείδηση, NKX2-8, καρκίνος μαστού, οστική μετάσταση, οστεοκλαστογένεση, PTHrP